兔外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液試劑盒說(shuō)明書
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
| 名稱 | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 |
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A | XXXX 動(dòng)物外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液 |
| 200ml |
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B | 樣本稀釋液（贈(zèng)品） | 2010C1119 | 200ml |
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C | 清洗液（贈(zèng)品） | 2010X1118 | 200ml |
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D | 說(shuō)明書 |
| 1 份 |
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【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
A． 適用儀器
zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
B． 耗材
| 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)地 |
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| 15ml 離心管散裝 | 339650 | 美國(guó) NUNC |
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| 15ml 離心管架裝 | 339651 | 美國(guó) NUNC |
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| 50ml 離心管散裝 | 339652 | 美國(guó) NUNC |
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| 50ml 離心管架裝 | 339653 | 美國(guó) NUNC |
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| 無(wú)菌膠頭滴管或塑料滴管 |
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【檢驗(yàn)方法】 |
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全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例加入樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119）混勻，根
據(jù)稀釋后的樣本量大小，分以下兩種情況：
情況 A：稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
- 取一支 15ml 離心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液（注：分離液zui少不得少于 3ml）。
- 用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上，400-500g ，離心 20-30min（注： 根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離 心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果）。
- 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè) 核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
- 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，在離心管中加 入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
- 250g，離心 10min。
- 棄上清。
- 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
- 250g，離心 10min。
- 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
情況 B：稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
- 取一支適當(dāng)?shù)碾x心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液。
- 將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上，500-650g（zui大離心力可至 1000g）， 離心 20-30min。（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心 時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果。加入血液樣本后，樣 本及分離液總體積不得超過(guò)離心管總體積的三分之二）。
- 剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟 9。
【注意事項(xiàng)】
- 全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，zui 好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過(guò) 6h 后 分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
- 本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
- 吸取過(guò)多的單個(gè)核細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的
粒細(xì)胞數(shù)量增加。
- 吸取過(guò)多的單個(gè)核細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
- 分離液用量大于稀釋后血液樣本時(shí)，分離效果更佳。
- 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)以尋求幫助，具體詳 見(jiàn)下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗(yàn)單個(gè)核細(xì)胞提取率及純度均大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
| 紅細(xì)胞 |
| 白細(xì)胞 |
| 血小板 |
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| （4.0-10.0）×109 |
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含量（個(gè)/L） | （4.0-5.5）×1012 | 中性粒細(xì)胞 | 淋巴細(xì)胞 | 單核細(xì)胞 | （1.0-3.0）×1011 |
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| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% |
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【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
- 所獲得單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
- 所獲得單個(gè)核細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
- 所獲得單個(gè)核細(xì)胞的鑒定方法 A.流式細(xì)胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR 技術(shù)
注：上述技術(shù)方案詳情請(qǐng)登陸本搜索“細(xì)胞分離、
純化、擴(kuò)增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊(cè)”，并在說(shuō)明書項(xiàng)目欄下下載使用。
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：
出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 | |
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離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過(guò)小或離心時(shí)間過(guò)短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 | |
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離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | ||
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離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過(guò)大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 | |
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離心后白環(huán)層太淺或看不見(jiàn) | 細(xì)胞密度過(guò)小 | ||
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- 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離 心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
- 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到分離效果，
離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。
