固相載體的選擇和試劑的制備
ELISA的主要試劑為固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶的反應(yīng)底物。
1.固相載體的選擇
ELISA可用許多不同類型的固相如纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡萄糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠和含F(xiàn)e2O3的磁性聚苯乙烯等材料，這些材料一共價(jià)鍵與抗原或抗體結(jié)合，但有其缺點(diǎn)，除含鐵的顆粒外，其他材料ELISA沖洗步驟中都要離心。如果固相用微量板或微量管，大顆粒或透明小燒杯就不需要離心，這些固相都是用聚苯乙烯、聚乙烯和尼龍材料制成的。固相可以預(yù)先用r射線或紫外光處理也可以不處理。幾乎所有的塑料都有吸附蛋白質(zhì)的能力，一般認(rèn)為聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。另外聚苯乙烯在ELISA測定過程中作為載體和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)，加之他的價(jià)格低廉，可制成各種形狀，故被普遍采用。聚乙烯的吸附能力雖好，但因材料本身質(zhì)軟使操作不便，聚丙烯的吸附性能差，故聚乙烯和聚丙烯的使用都很少。聚苯乙烯經(jīng)過射線照射后對蛋白質(zhì)，特別是免疫球蛋白吸附性能增加，應(yīng)用于ELISA雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時(shí)空白值較大。
為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)勢可將陽性和陰性參考血清分別稀釋后在不同的固相載體上按選擇的ELISA操作步驟進(jìn)行，顯色后比較每孔溶液的吸光值。在哪種載體上的陽性和陰性參考血清的反應(yīng)差別zui大，表明哪種固相zui為合適。
ELISA載體的形狀只要有三種：小試管、小珠和微量酶標(biāo)板。小試管的特點(diǎn)是可用作反應(yīng)的容器，zui后放入分光光度計(jì)中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面磨砂后吸附面積大大增加，如用特殊的洗滌器，在洗滌的過程中使圓珠滾動(dòng)淋洗，效果更好。zui常用的載體為微量酶標(biāo)板，于ELISA的產(chǎn)品稱為ELISA板。上標(biāo)準(zhǔn)的微量酶標(biāo)板是96孔微量板。
ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測，并可在酶標(biāo)儀上迅速讀出結(jié)果。現(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量酶標(biāo)板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、孵育、比色等步驟，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。
由于酶標(biāo)板在各個(gè)方面存在一些差異，因此選擇的酶標(biāo)板不僅需要于ELISA的酶標(biāo)板，而且還要考慮板的吸附能力和各孔的均質(zhì)性。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于材料的不同和制作工藝的差別，各種商品酶標(biāo)板質(zhì)量差異很大。
